大连化物所和精密测量院Angew：利用原位化学交联解码细胞中蛋白质动态结构的策略

活细胞内蛋白质的原位动态结构对于揭示其生物学功能至关重要。随着深度学习算法助力蛋白质结构预测的发展迭代，AlphaFold2实现了对蛋白质结构的全面预测，然而该方法对柔性区域的结构预测仍面临巨大挑战。近年来，原位化学交联-质谱技术（in vivo XL-MS）以高通量、高灵敏且对蛋白质纯度要求低等优势，在解析活细胞内蛋白质的原位动态结构方面展示出巨大潜力。

近日，中国科学院大连化学物理研究所赵群研究员和张丽华研究员等人和中国科学院精密测量科学技术创新研究院龚洲副研究员合作，提出了利用in vivo XL-MS解码细胞中蛋白质动态结构的策略。该策略将AlphaFold2的结构作为先验信息，结合in vivo XL-MS数据与多种结构计算方法评估结构与交联信息的匹配度，重构了细胞内多种蛋白质，尤其是多结构域蛋白质和固有无序蛋白质（intrinsically disordered protein，IDP）的原位动态结构。为深入研究蛋白质在细胞微环境中发挥功能的分子机制提供了关键技术支撑。

本工作中，研究团队首先对课题组前期建立的原位XL-MS数据集进行了评估，包含26261个蛋白质内交联，对应于人类蛋白质组中的4914个蛋白质。结果表明，这些蛋白质分布于整个丰度范围和所有细胞区室中，具有不同的长度和生物功能。此外，对所有交联残基的结构分布进行了统计分析。结果发现，大约38%的交联残基分布在非结构化区域，而这些残基往往具有较低的pLDDT得分。也就是说，交联捕获了AlphaFold2较难预测的柔性区域的位点信息。通过结合XL-MS数据，能够进一步提高AlphaFold2对柔性蛋白质的准确预测能力。

图1. 对XL-MS数据的评估

随后，作者利用课题组前期建立的原位XL-MS数据集对AlphaFold2预测结构进行评估。为了避免同源寡聚体交联数据的干扰，作者在后续的结构分析中去除了潜在可能形成同源寡聚体的蛋白质（UniProt中注释）。将XL-MS数据集映射到AlphaFold2预测结构，发现两个位点均位于结构区域内的交联信息表现出较好的结构吻合度，而至少一个位点位于非结构化区域内的交联信息则显示出较低的结构吻合度。随着蛋白质非结构化区域长度的增加，蛋白质结构变得更加动态，与XL-MS数据的相容性随之降低，尤其是对于IDP而言。这可能反映了蛋白质在体内的不同功能状态或组装过程。因此，利用in vivo XL-MS研究细胞内蛋白质的不同结构状态具有重要且合理的意义。

图2. XL-MS数据对AlphaFold2预测结构的表征

接着，研究团队首先提出了一种多结构域蛋白质的结构重构策略，该策略将结构域作为整体，利用结构域间的XL-MS数据对细胞内蛋白质动态结构建模。利用这种整体重构策略，团队成功表征了钙调蛋白(CaM)、hnRNP A1和hnRNP D0三种蛋白质在细胞内的动态结构。CaM在体外已经有了详细的研究，对其动态结构的准确表征验证了该方法的可靠性。hnRNP A1具有已被解析的体外静态结构，而通过该策略，则成功解码了另一种可替代结构，其中RRM2向RRM1的另一侧发生了移动。hnRNP D0则没有已知的体外全长静态结构，通过该策略揭示了在细胞内形成的两个RRM结构域之间的全长系综构象。

图3. 多结构域蛋白质动态结构解析策略及其在细胞内的动态结构

进一步，研究团队将解析了IDP在细胞内的系综构象。IDP具有丰富且重要的生物学功能，然而其高度的动态性使得传统的结构生物学方法难以解析其结构，而AlphaFold2等预测算法对于IDP的预测精度也普遍不高。针对这一问题，研究团队提出了两种互补的结构表征策略，一是将XL-MS信息直接转换为距离约束用于IDP结构的计算，二是首先使用全原子分子动力学模拟进行无偏采样，然后基于XL-MS数据对采样结构进行评估和筛选。利用这两种互补的研究策略，团队成功解码了两种高速泳动组蛋白HMG-I/Y和HMG-17在细胞内的系综构象。这两种互补的结构表征策略一方面实现了对IDP分子构象的全面采样，另一方面通过结构聚类与重评估方法保证了结果的准确性与可靠性，避免了可能出现的过拟合状态，从而全面且客观地重构IDP在细胞内的系综构象。

图4. IDP系综构象解析策略及其在细胞内的系综构象

综上所述，作者提出的体内XL-MS结合分层分析策略为解析蛋白质动态结构提供了重要的技术方法。这一策略有望在AlphaFold2的基础上解码所有蛋白质的动态结构，尤其是高度动态的IDP在活细胞内的动态结构。该研究为我们深入了解蛋白质在细胞中的功能提供了关键的工具和方法。

相关论文发表于Angewandte Chemie International Edition，该工作的通讯作者是大连化学物理研究所的张丽华研究员、赵群研究员和中国科学院精密测量科学技术创新研究院的龚洲副研究员。第一作者是大连化学物理研究所的博士研究生张蓓蓉。该工作得到了国家自然科学基金、国家重点研发计划、中科院青促会等项目的资助。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Decoding Protein Dynamics in Cells Using Chemical Cross-Linking and Hierarchical Analysis

Beirong Zhang, Zhou Gong, Lili Zhao, Yuxin An, Hang Gao, Jing Chen, Zhen Liang, Maili Liu, Yukui Zhang, Qun Zhao, Lihua Zhang

Angew. Chem. Int. Ed., 2023, DOI: 10.1002/anie.202301345

导师介绍

赵群

https://www.x-mol.com/university/faculty/364205 

张丽华

https://www.x-mol.com/university/faculty/22784