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浙江大学林世贤团队JACS:活细胞内增强阳离子-π相互作用的设计及其应用

阳离子-π相互作用是发生在阳离子与带有共轭π电子云之间的非共价相互作用(Noncovalent Interactions)之一,其在生物分子的识别、黏连、折叠和自组装等多个生物过程中发挥核心作用 [1-2]特别是在生物分子的识别领域,一系列经典的研究确立了阳离子-π相互作用在神经元受体-配体相互作用和表观遗传调控中的关键作用 [3-8]2022年,浙江大学生命科学研究院林世贤实验室首次报道了利用色氨酸类似物调控阳离子-π相互作用的工程改造策略,并通过该策略增强组蛋白甲基化修饰与其解码蛋白的亲和力,从而构建了一种组蛋白甲基化修饰的超级读码器(Super-Reader)用于H3K4me3的检测和成像 [9]然而,该超级读码器仅限于体外应用,其在活细胞中的适用性仍完全未知。


林世贤实验室在该领域继续探索,近日,他们在Journal of the American Chemical Society 杂志发表研究论文,阐释了利用色氨酸类似物调控阳离子-π相互作用的广谱适用性,在活细胞内实现阳离子-π相互作用的增强,并构建了系列可应用于活细胞的组蛋白甲基化修饰的超级读码器,在活细胞中富集和检测组蛋白甲基化修饰,同时利用超级读码器的邻近标记揭示了H3K4me3的蛋白互作网络。

图1. 活细胞内工程改造组蛋白甲基化读码器增强阳离子-π相互作用的示意图


在2022年的工作中,作者发现强给电子基团取代的色氨酸类似物6-甲氧基-色氨酸(6MeOW)取代KDM5A的PHD3结构域的“芳香笼”中的关键色氨酸促使组蛋白H3K4me3与PHD3变体(ePHD)的亲和力提高数倍 [9]由于π相互作用的强弱与π效应的电子云密度密切相关,由此作者推测,强给电子基团取代的芳香族氨基酸类似物能够提高π效应的电子云密度,从而提高生物大分子与底物之间的亲和力,由此推测更富电子的色氨酸类似物取代将进一步提高阳离子-π相互作用的结合能。因此,在该JACS研究中,作者首先探究了双富电子取代的色氨酸类似物,如6,7-甲基-色氨酸(DiMeW)、6,7-甲氧基-色氨酸(DiMeOW)和6,7-二氢呋喃-色氨酸(DHFW),是否能够增强阳离子-π相互作用。研究结果表明色氨酸吲哚环C6位置的单甲氧基取代比C6和C7位置的双取代对阳离子-π相互作用的影响更大,说明C7位置的取代可能由于位阻效应破坏蛋白质与配体之间的相互作用。

图2. 强给电子基团取代的色氨酸类似物调控组蛋白甲基化修饰与其读码器蛋白间的阳离子-π相互作用


为了探究该策略的广谱适用性,作者进一步设计针对组蛋白甲基化修饰H3K9me3、H3K27me3和H3K36me3的超级读码器,通过遗传密码拓展技术 [10-11] 将强给电子基团取代的芳香族氨基酸类似物位点特异性地引入H3K9me3、H3K27me3和H3K36me3的读码蛋白中。研究结果表明通过6-甲氧基-色氨酸的取代能够显著性提高组蛋白甲基化修饰(H3K9me3、H3K27me3和H3K36me3)与其解码蛋白的亲和力达到2-9倍,证明了该策略在提高组蛋白甲基化修饰与其解码蛋白亲和力领域具有广谱适用性。

图3. 设计强亲和力的组蛋白甲基化修饰读码器。


作者紧接着探究了该策略是否在活细胞中增强组蛋白甲基化修饰与其读码蛋白的阳离子-π相互作用。作者首先优化了嵌合体苯丙氨酸翻译系统 [10-11] 在哺乳动物中识别6-甲氧基-色氨酸的效率,建立了在H3K4me3解码蛋白PHD的“芳香笼”特定位点引入6-甲氧基-色氨酸的哺乳动物细胞表达系统,随后作者通过核小体免疫共沉淀和核质分离实验证实了在活细胞中6-甲氧基-色氨酸取代的解码蛋白能够增强其对H3K4me3的亲和力,且不改变其底物特异性。

图4. 活细胞中利用强给电子基团取代的色氨酸类似物增强H3K4me3与其读码器蛋白PHD的阳离子-π相互作用。


最后,作者将改造的超级读码器ePHD应用于在活细胞中成像H3K4me3和结合邻近标记技术 [12] 捕获处于H3K4me3微环境的蛋白。实验结果显示,由于ePHD在活细胞中结合H3K4me3的亲和力增强,其在成像H3K4me3时具有比天然PHD结构域更好的信噪比,也能够鉴定到更多H3K4me3相互作用的微环境蛋白质。

图5. 超级读码器应用于成像和捕获H3K4me3的相互作用网络。


总体来说,该工作在活细胞中通过遗传密码拓展技术在组蛋白甲基化读码蛋白的特定位点引入富电子基团取代的色氨酸类似物,以操纵读码蛋白结构域的阳离子-π相互作用,并将其应用于活细胞内组蛋白甲基化修饰的成像和微环境蛋白质组的捕获,为活细胞环境下操纵阳离子-π相互作用和原位研究表观遗传调控提供了新的研究思路和化学工具。


据悉,该论文还将入选JACS 杂志封面。博士后赵红霞和博士生唐玲、方为论文共同第一作者,林世贤研究员为论文通讯作者。该工作得到了国家重点研发计划项目、国家重大研究计划、国家自然科学基金项目和中国博士后科学基金项目等项目的资助。


原文(扫描或长按二维码,识别后直达原文页面,或点此查看原文):

Manipulating Cation−π Interactions of Reader Proteins in Living Cells with Genetic Code Expansion

Hongxia Zhao, Ling Tang, Yu Fang, Chao Liu, Wenlong Ding, Shunping Zang, Yulin Chen, Wenyuan Xu, Ying Yuan, Dong Fang, and Shixian Lin*

J. Am. Chem. Soc.2023, DOI: 10.1021/jacs.3c02293


参考文献:

1. Gallivan, J. P.; Dougherty, D. A., Cation-pi interactions in structural biology. Proc Natl Acad Sci U S A 199996 (17), 9459-64.

2. Zacharias, N.; Dougherty, D. A., Cation-pi interactions in ligand recognition and catalysis. Trends Pharmacol Sci 200223 (6), 281-287.

3. Zhong, W.; Gallivan, J. P.; Zhang, Y.; Li, L.; Lester, H. A.; Dougherty, D. A., From ab initio quantum mechanics to molecular neurobiology: a cation-pi binding site in the nicotinic receptor. Proc Natl Acad Sci U S A 199895 (21), 12088-93.

4. Brejc, K.; van Dijk, W. J.; Klaassen, R. V.; Schuurmans, M.; van Der Oost, J.; Smit, A. B.; Sixma, T. K., Crystal structure of an ACh-binding protein reveals the ligand-binding domain of nicotinic receptors. Nature 2001411 (6835), 269-76.

5. Hughes, R. M.; Wiggins, K. R.; Khorasanizadeh, S.; Waters, M. L., Recognition of trimethyllysine by a chromodomain is not driven by the hydrophobic effect. Proc Natl Acad Sci U S A 2007104 (27), 11184-11188.

6. Taverna, S. D.; Li, H.; Ruthenburg, A. J.; Allis, C. D.; Patel, D. J., How chromatin-binding modules interpret histone modifications: lessons from professional pocket pickers. Nat Struct Mol Biol 200714 (11), 1025-1040.

7. Xiu, X.; Puskar, N. L.; Shanata, J. A.; Lester, H. A.; Dougherty, D. A., Nicotine binding to brain receptors requires a strong cation-pi interaction. Nature 2009458 (7237), 534-537.

8. Patel, D. J.; Wang, Z., Readout of epigenetic modifications. Annu Rev Biochem 201382, 81-118.

9. Zhao, H.; Liu, C.; Ding, W.; Tang, L.; Fang, Y.; Chen, Y.; Hu, L.; Yuan, Y.; Fang, D.; Lin, S., Correction to "Manipulating Cation-pi Interactions with Genetically Encoded Tryptophan Derivatives". J Am Chem Soc 2022144 (24), 11044.

10. Ding, W.; Zhao, H.; Chen, Y.; Zhang, B.; Yang, Y.; Zang, J.; Wu, J.; Lin, S., Chimeric design of pyrrolysyl-tRNA synthetase/tRNA pairs and canonical synthetase/tRNA pairs for genetic code expansion. Nat Commun 202011 (1).

11. Zhao, H.; Ding, W.; Zang, J.; Yang, Y.; Liu, C.; Hu, L.; Chen, Y.; Liu, G.; Fang, Y.; Yuan, Y.; Lin, S., Directed-evolution of translation system for efficient unnatural amino acids incorporation and generalizable synthetic auxotroph construction. Nat Commun 202112 (1).

12. Branon, T. C.; Bosch, J. A.; Sanchez, A. D.; Udeshi, N. D.; Svinkina, T.; Carr, S. A.; Feldman, J. L.; Perrimon, N.; Ting, A. Y., Author Correction: Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID. Nat Biotechnol 202038 (1), 108.


研究团队简介


浙江大学林世贤实验室聚焦于中心法则的翻译过程,通过整合交叉学科的研究手段,探索tRNA和蛋白质修饰的生物学功能和工程改造,并致力于开发新型生物医药,用于重大疾病和罕见遗传病的诊疗。有志于交叉学科或生物医药研发的博士后和研究人员可发送邮件到sxlin@zju.edu.cn申请加入。


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