武汉大学冯钰锜教授课题组近年来工作概览

冯钰锜，武汉大学化学与分子科学学院教授，武汉大学公共卫生学院和中南医院交叉研究院兼职教授，国家杰出青年科学基金获得者，教育部新世纪优秀人才计划入选者，湖北省创新研究群体负责人，武汉市创新岗位特聘专家，中国化学会色谱专业委员会委员，中国质谱学会学术委员。主要研究方向为分离分析技术、基于质谱技术的代谢组学分析新方法、亚代谢组数据库构建等。至今已发表SCI论文600余篇，被引用24900余次，H因子81（谷歌学术），连续九年（2014-2022）入选爱思唯尔（Elsevier）发布的“中国高被引学者”（Highly Cited Chinese Researchers）榜单。分别获得教育部提名国家科学技术奖(自然科学奖)一等奖( 2005年)、湖北省自然科学奖二等奖获得者(2014年)、国家科技进步二等奖获得者（2014年）。担任Journal of Chromatography A 共同主编（2018-2020）、《色谱》责任副主编、《分析化学》、《分析科学学报》等杂志编委，Advances in Sample Preparation 顾问编委。

本文选取冯钰锜教授课题组近年来在基于衍生化技术的色谱-质谱分析方法领域的几个相关研究工作进行简要介绍。

（一）点击化学-质谱探针技术示踪大鼠体内邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯的代谢足迹

邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）是世界上使用最广、产量最大的增塑剂。DEHP也是一种典型的内分泌干扰物，在动物体内具有模拟雌激素的功能，从而严重影响内分泌。DEHP暴露会导致多种不良的生物效应，包括生殖毒性、免疫毒性、胚胎毒性、肝毒性、神经毒性和致癌性等。近年来，研究证据表明，DEHP的体内代谢物是其不良生物学效应的主要媒介，而非其母体本身。然而，目前对DEHP的代谢物的分子多样性及其代谢过程的了解很有限。因此，发展高效的DEHP体内代谢物分析技术，揭示 DEHP 在生物体内的代谢，对于阐明DEHP暴露诱导毒性和疾病的潜在机制具有重要意义。

最近，该团队发展了一种点击化学结合质谱探针策略（CC-MS），以适用于DEHP体内代谢深度示踪。通过合成炔基修饰的DEHP类似物和一对新型质谱探针（4-ANPA及其氘代试剂d₅-4-ANPA），加上液相色谱-质谱（LC-MS）分析技术，开发了一种高选择性和高灵敏度的CC-MS策略，用于示踪大鼠体内的DEHP代谢（图1）。该策略成功地从大鼠的尿液、粪便和血清中发现了247种潜在DEHP代谢物，远远超过了文献中报道的35个DEHP代谢物。借助分子网络技术（GNPS）和质谱解析技术，已经成功注释了MEHP衍生物、2-乙基己醇（2-EH）衍生物、葡萄糖醛酸结合型代谢物和邻苯二甲酸双酯类代谢物等四类代谢物信息。此外，研究还揭示了一条新的DEHP代谢途径，即DEHP首先被氧化，然后水解为邻苯二甲酸单酯和2-EH的衍生物。该研究工作发展的CC-MS策略是一种高效的污染物代谢示踪方法，这些新发现的DHEP代谢物大大扩展了关于DEHP体内代谢的认识。它们提供的重要线索，有助于更好地理解DEHP诱导的毒性和疾病的潜在机制。相关工作发表于Journal of Hazardous Materials 上（J. Hazard. Mater., 2023, 452, 131190）。

图1. 点击化学-质谱探针策略。（A）DEHP示踪剂alkyne-DEHP的化学结构。（B）一对MS探针4-ANPA/ d₅-4-ANPA 的化学结构。（C）4-ANPA通过CuAAC反应标记。（D）CC-MS策略的示意图。给大鼠灌胃alkyne-DEHP，随后收集取它们的尿液、粪便和血清并提取，并用4-ANPA和d₅-4-ANPA标记。将标记样品均匀混合，然后通过LC-HRMS进行分析。

图2. DEHP潜在代谢物的分子网络。分子网络利用注释的信息进行着色，每个节点代表着一个筛查出的潜在DEHP代谢物。紫色的节点为葡萄糖醛酸结合物，蓝色的节点为MEHP衍生物，橙色的节点为2-EH衍生物，绿色的节点为邻苯二甲酸双酯类代谢物，灰色节点代表没有注释的代谢物。

（二）胆汁酸的深度分析及新结合物的发现

胆汁酸（Bile acid, BA）是一类重要的肠道微生物群-宿主共代谢物，在脂质、有毒代谢物和外源物的营养吸收以及维持肝和胆道的生理功能等方面具有重要的生理功能。肠道微生物群是胆汁酸代谢的重要器官，可以通过五种方式：去结合甘氨酸或牛磺酸、去羟基化、脱氢、差向异构化，以及结合氨基酸，综合合成多种次级胆汁酸。

为了深入探究宿主-肠道菌共代谢胆汁酸的分子多样性，近两年来，该团队以胆汁酸为研究对象，建立了两套胆汁酸分析策略：衍生化辅助的双电压扫描质谱策略和基于MRM(±)的氨基酸结合型胆汁酸（AA-BAs）深度分析策略。

其中，衍生化辅助的双电压扫描质谱策略通过AMPP（4-氨甲基苯基吡啶）标记的选择性提高胆汁酸类化合物的结构稳定性，实现胆汁酸类物质与其他化合物的有效区分。利用该方法，他们首次发现了由肠道菌介导合成的两类新型的氨基酸结合型胆汁酸（丙氨酸、脯氨酸结合式）和乙酰化胆汁酸结合物（Anal. Chem., 2022, 94: 2655-2664）。

图3. 基于LC-ESI-Q-TOF MS的交替双电压扫描质谱法工作流程示意图

此外，他们还发展了基于MRM(±)的氨基酸结合型胆汁酸深度分析策略（Anal. Chim. Acta, 2023, 1239: 340691）。运用该技术，他们从人粪便样品中又新发现了14类氨基酸与胆汁酸的结合式，其中包括69种新的AA-BA分子。该研究还发现慢性睡眠剥夺模型小鼠粪便中50种AA-BAs水平均显著下降，说明这些新发现的胆汁酸结合物与宿主的生理、病理状态高度相关。

图4. (A) 20种常见氨基酸与游离C24胆汁酸之间的理论酰胺化；(B) MRM(±) -MS方法分析氨基酸偶联胆汁酸的示意图

总的来说，胆汁酸的全分析研究工作为新型胆汁酸的发现和表征提供了有效的分析工具。这些研究结果有效拓宽了胆酸池组成的认识，对于深入了解胆汁酸的宿主–肠道菌代谢机制也具有重要意义。

（三）pH敏感型化学选择性探针的设计、合成及应用

化学选择性标记是蛋白质组学和代谢组学研究的有效工具。化学选择性探针通常由质谱标记探针（含有质谱增敏基团和反应基团）和固相基质两个部分组成。通过连接和切割这两个部分，可从复杂的生物基质中捕获、富集和释放特定代谢物，以实现代谢组学分析。然而，现有的很多化学选择性标记策略需要较长的孵育时间，长达数小时甚至数天，并且需要同位素标签进行识别和定量。这两个问题制约了化学选择性标记在高通量和常规分析中的应用。

为解决这些问题，该团队在前期整体柱微萃取和化学标记的研究工作基础上，设计了一种基于整体材料上硼酸酯反应的快速高效的化学选择性标记策略。在该工作中，分别设计了两种材料，一种是表面含有顺式二羟基的整体材料，另一种是两端分别含有硼酸基团和氨基反应基团的探针分子。质谱探针分子结构上的硼酸基团通过pH快速响应的硼酸酯反应可与整体材料的顺式二羟基进行固定和释放，氨基反应基团则用于标记羧基代谢物。由于丰富的反应位点和整体材料独特的孔道结构，该化学选择性探针和代谢物的标记时间仅需要10分钟。此外，硼元素标签具有天然同位素丰度，可以通过质谱快速识别标记的代谢物，不仅提高了样品利用率，而且无需使用昂贵的同位素试剂，避免了色谱分离中的同位素效应（图5）。

通过该技术，他们成功地分析了酵母细胞、血清和粪便样本中34种羧基代谢物（如图6所示）。与非标记的液相色谱质谱联用的方法相比，本方法提高了约两个数量级的灵敏度。因此，该技术在复杂样品高灵敏度分析领域有着广阔的应用前景（Angew. Chem. Int. Ed., 2022, 61, e202208138）。

图5. pH敏感型化学选择性探针示意图

图6. 基于pH敏感型化学选择性探针技术的34种短链脂肪酸定量分析

（四）基于色谱保留规律的同分异构体代谢物鉴定研究

（1）生物活性脂质分子FAHFAs的发现和鉴定研究

羟基脂肪酸支链脂肪酸酯（FAHFAs）是 2014 年在哺乳动物脂肪组织中发现的一类新型功能化脂类分子。FAHFAs具有改善葡萄糖耐量，增强胰岛素敏感性，维持血糖稳态，抗肥胖型相关炎症炎等重要的生理功能，已被证明与肥胖、糖尿病、癌症及免疫性疾病都密切相关。

以FAHFAs为研究对象，该团队建立了化学同位素标记结合液相色谱-质谱的 FAHFAs 深度筛查和鉴定策略（图7）。DMED和d₄-DMED试剂标记在实现FAHFA分析的质谱信号增敏的同时，还以在二级质谱分析中提供了特征FAHFA产物离子信息。基于此，他们通过虚拟FAHFA代谢物的方式，构建了基于MRM模式的高灵敏、高选择性FAHFA深度筛查方法。利用该筛查技术，他们首次在水稻和拟南芥中检测到 49 个 FAHFA家族，共 262 个异构体。此外，他们还发现FAHFA异构体在反相C18 柱的色谱保留遵循“酯基位置规律”和“碳数规律”。基于这两套特征的色谱保留规律，新构建了适用于FAHFA异构体的色谱定量结构保留鉴定模型，实现了无标准品的FAHFA新分子结构鉴定。该工作极大的丰富了关于FAHFA分子多样性的认识，为将来探索FAHFAs生物合成和生物功能提供了基础科学数据（Anal. Chem., 2018, 90: 10056-10063）。

图7. 化学同位素标记结合液相色谱-质谱的 FAHFAs 深度筛查和鉴定策略

（2）色谱保留与质谱裂解规律集成的羟基脂肪酸结构注释策略

羟基脂肪酸（OH-FAs）是一类重要的生物信号分子，也是FAHFA合成的重要前体化合物。深度筛查和注释OH-FA异构体对于研究其体内代谢和生物功能具有重要意义。针对OH-FA异构体种类繁多、结构复杂难以定性的问题，该研究团队提出了一种综合色谱保留规律和质谱裂解规律的鉴定策略，以实现痕量OH-FAs的结构鉴定。通过建立基于双碳数规律的OH-FA异构体保留指数预测模型，成功预测了碳数为C8-C18区间内所有OH-FA异构体的色谱保留值（详见图8）。此外，根据DMED标记后，OH-FAs衍生产物离子强度比值与OH-FAs羟基位置的关系，辅助鉴定OH-FA异构体。利用上述鉴定策略，研究人员准确鉴定了人体血清、水稻幼苗和蜂蜜中的97种OH-FAs分子，其中23种OH-FAs分子为首次报道。该研究为在有限标准品条件下广泛识别OH-FAs提供了新的参考（Anal. Chem., 2020, 92: 14528-14535）。

图8. 基于n1-和n2-碳数规律的OH-FAs保留值循环预测鉴定

（五）脱落酸新分解代谢产物及其相关酶的发现和鉴定

脱落酸（ABA）是一种重要的植物激素，在调节植物的正常生长发育和植物对胁迫的响应中都发挥了非常重要的作用。ABA的氧化代谢包含7′-、8′-和9′-羟基化途径，其中8′-羟基化途径是ABA的主要氧化代谢途径。在8′-羟基化途径中，具有部分ABA活性的红花菜豆酸（PA）在还原酶的作用下，生成失活产物二氢红花菜豆酸（DPA）。由于普遍认为9′-羟基化途径的代谢只是8′-羟基化代谢的副反应，因此ABA 9′-羟基化代谢途径并未受到广泛关注。

该研究团队利用一对轻重同位素质谱探针，结合液质联用发现了ABA 9′-羟基化代谢途径中neoPA的代谢产物。通过质谱解析、化学计算、同位素示踪、化学合成等技术，鉴定了新发现的neoPA代谢产物的结构，并命名为epi-neoDPA（图9）。在此基础上，该团队利用LC-MS和RNA-Seq技术，分别对不同拟南芥组织中epi-neoDPA的含量和基因表达量进行分析。通过关联分析和体外酶活性实验，鉴定到了转化neoPA为epi-neoDPA的还原酶NeoPAR1 (neoPA reductase 1)。

图9. 脱落酸9′-羟基化代谢途径中neoPA代谢产物的发现与鉴定

在对NeoPAR1 过表达株系和缺失突变体分析时，该团队发现NeoPAR1可以负调控ABA的水平，从而影响拟南芥的种子萌发（图10）。有趣的是，该团队发现NeoPAR1缺失后种子的萌发表型和此前报道的PA还原酶（ABH2和CRL1）缺失后种子的萌发表型相反。通过对ABA及其代谢物含量分析，发现PA还原酶的表达异常会改变PA水平，并不会对ABA的水平产生显著影响；相反，NeoPAR1 的过量表达或者缺失，会导致植物种子中的ABA水平显著的改变。论文作者认为PA还原酶是通过调控体内具有部分ABA活性的PA来调控种子萌发；而NeoPAR1是通过调控ABA水平，从而影响种子的萌发。上述结果表明，ABA的9′-羟基化途径对ABA水平具有独特的调控方式，但是其详细调控机制仍有待探究（Plant Commun., 2022, 5, 100340）。

图10. NeoPAR1负调控拟南芥的种子萌发

导师介绍

冯钰锜

https://www.x-mol.com/university/faculty/13605