基于点击化学反应的纳米电极实现单个线粒体原位捕获及动态分析

单个活细胞内众多细胞器之间存在复杂的通讯过程，在调控细胞信号通路中发挥着重要的作用。在单细胞器水平原位获取分子动态信息是理解这些机制的重要手段，然而技术手段非常匮乏。经典电化学分析思路是将纳米电极置于活细胞内目标细胞器附近，对其释放的分子加以检测；然而，该方法无法避免邻近细胞器释放的同种分子对测量过程的干扰。因此，实时动态监测活细胞内单个细胞器中目标分子仍然是单细胞分析领域长期存在的挑战之一。

近日，南京大学江德臣教授团队的潘荣容博士和李劼教授合作，基于点击化学反应，通过将二苯并环辛基（DBCO）修饰于纳米毛细管针尖，利用针尖处DBCO基团与靶向富集于线粒体中的叠氮取代三苯基膦（TPP-N₃）之间发生快速点击化学反应，将单个目标线粒体捕获于管针尖。该方法使毛细管内电化学检测器与被捕获的单个线粒体在活细胞内形成一个独立的检测区域，可避免细胞质中其他分子的干扰，从而可实现原位动态监测单个线粒体中活性氧（ROS）。

图1. 基于点击化学反应的纳米电极用于单个线粒体原位捕获及动态分析原理图

首先，在纳米毛细管针尖内部构建出具有高电催化活性的铂纳米界面，作为管内电化学检测器。利用化学修饰将DBCO基团引入到毛细管针尖。所构建的电化学检测器对过氧化氢的检测灵敏度低至0.2 μM。

将纳米毛细管电极扎入到单个活细胞中，接触单个目标线粒体，等待1 min。在此期间，管针尖处DBCO基团与线粒体中TPP-N₃之间发生快速点击化学反应，固定单个目标线粒体于管针尖。轻微移动针尖，发现针尖处的线粒体随针尖同步运动，表明纳米毛细管电极成功捕获到单个线粒体。

随后，利用佛波酯（PMA）刺激细胞产生胞内氧化压力。对刺激前后线粒体中活性氧（ROS）释放过程进行动态监测。发现单个线粒体释放ROS达到峰值的响应时间（6.0±2.8 s）大于细胞质中ROS达到峰值时间（0.97±0.7 s），这是首次在单个线粒体水平揭示了其中独特的ROS诱导ROS释放（RIRR）的分子机制。

铁死亡是近年来发现的一种新型细胞程序性死亡方式。目前，关于线粒体中的谷胱甘肽过氧化物酶（GPX4）在RSL3诱导的细胞铁死亡信号通路中作用存有争议。因此，团队利用构建的技术对该过程进行单线粒体水平的精细探究。结果表明RSL3通过作用于细胞质中的GPX4诱导细胞铁死亡，而不是作用于线粒体中的GPX4。这一研究结果将有助于深入了解细胞铁死亡的分子机制。

综上，该工作利用点击化学反应，首次将活细胞内单个线粒体捕获于毛细管电极针尖，实现对单个线粒体中分子的原位动态测量。该技术的成功构建将进一步推动电分析技术在亚细胞分析方向的发展，并最终为生物学研究提供更多有价值的信息。

相关成果发表在Angewandte Chemie International Edition 上，文章的第一作者是南京大学博士研究生刘康，通讯作者为南京大学李劼教授和江德臣教授团队的潘荣容博士。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Click-Chemistry-Enabled Nanopipettes for the Capture and Dynamic Analysis of a Single Mitochondrion inside One Living Cell

Kang Liu, Zheng Zhang, Rujia Liu, Jie P. Li, Dechen Jiang, Rongrong Pan

Angew. Chem. Int. Ed., 2023, DOI: 10.1002/anie.202303053

导师介绍

江德臣

https://www.x-mol.com/university/faculty/11521 

李劼

https://www.x-mol.com/university/faculty/66064