一种高效识别蛋白精氨酸鼠李糖基化多克隆抗体

在很长一段时间内，蛋白质糖基化修饰被认为局限于真核生物。而今天人们广泛接受了包括重要的人类病原体在内的细菌当中也含有大量的O-以及N-糖基化修饰。但是其中关于N-糖基化修饰的报道似乎仅仅发生于天冬酰胺上，直到2013 年，北京生命科学研究所邵峰课题组和澳大利亚墨尔本大学Hartland课题组同时发现来源于肠致病性大肠杆菌 (EPEC) 的三型分泌系统效应蛋白NleB家族，以一种新颖的N-糖基化修饰Arg-N-GlcNAc作用于宿主的死亡受体 (TNFR，FAS，TRAIL-R等)及其接头蛋白 (FADD，TRADD，RIPK1 等)，通过阻断死亡结构域介导的DISC复合体的形成抑制死亡受体诱导宿主细胞凋亡和坏死。这些研究表明，精氨酸糖基化有可能广泛参与基因转录、信号转导、细胞生长与分化、细胞节律以及免疫等多个重要的生物学过程。

2015年，德国慕尼黑大学Lassak课题组在Nat. Chem. Bio.上报道了另一种重要的精氨酸鼠李糖基化修饰（Arg-N-Rha）。包括绿脓杆菌、百日咳菌、淋病奈瑟氏菌在内的多种致病菌都能特异性地通过EarP酶对转录延长因子EF-P中32位Arg进行N-Rha修饰，当Arg-N-Rha 的EF-P绑定到核糖体之后，其鼠李糖基化修饰的精氨酸能够到达转肽酶中心并为包含脯氨酸转移酶的tRNA提供有利位置，从而稳定了脯氨酰-tRNA的CCA末端，最终实现核糖体的解救。因此，Arg-N-Rha修饰在多种细菌的致病过程中发挥重要作用，而抑制EF-P 的Arg-N-Rha修饰可能成为一种开发新型抗生素的新策略 (Fig. 1) 。

Fig. 1 EF-P arginine rhamnosylation and mode of action

虽然目前存在着多种检测蛋白糖基化 (如蛋白Ser/Thr-O-GlcNAc修饰或Asn-N-糖基化修饰) 的手段和工具，但如何检测人蛋白组中是否还存在其它重要的Arg-N-Rha修饰蛋白尚缺乏相关工具。另外，特异性抗体的制备不仅对于基于抗体的大分子抗生素的设计有实践意义，而且能为新型小分子抗生素的筛选提供了十分有利的工具。

近日，由第二军医大学的胡宏岗教授课题组主导的包括德国慕尼黑大学、欧洲分子生物学实验室等多个研究团队在国际上首次成功开发了一种高效识别Arg-N-Rha的多克隆抗体。他们首先通过核磁手段确证了Arg-N-Rha修饰的构型，随后在固相上对多肽直接进行糖基化得到含有Arg-N-Rha的糖肽，并将糖肽与牛血清白蛋白(BSA)偶联作为抗原对家兔进行免疫，最终将得到的抗血清进行亲和纯化，首次得到特异性抗精氨酸鼠李糖基化的多克隆抗体(Anti-Arg^Rha) (Fig. 2)。

Fig. 2 Workflow of antibody generation

得到Anti-Arg^Rha后，由德国慕尼黑大学Lassak课题组利用ELISA和免疫印迹的手段验证了该抗体的特异性和灵敏度。结果表明： Anti-Arg^Rha能够特异性靶向EF-P^Rha，却不能识别没有糖基化修饰的EF-P。当EF-P^Rha浓度恒定在25 μg/ml (1.25 μM)时，最低可以使用0.04 μg/ml的抗体浓度来检测到EF-P^Rha。当保持Anti-Arg^Rha浓度恒定在2μg/ml时，最低能有效检测出15 ng的EF-P^Rha(Fig. 3)。其次，EF-P^Rha对Anti-Arg^Rha的特异性至少比L-鼠李糖、L-岩藻糖或L-精氨酸强10,000倍左右。此外， Arg-N-GlcNAc糖肽能够特异性地被Anti-ArgGlcNAc识别，但却丝毫不能被Anti-Arg^Rha识别。最后，他们还证明了该特异性抗体能够识别细胞裂解液中的内源性的精氨酸鼠李糖基化蛋白质。

Fig. 3 The Anti-Arg^Rha antibody specifically recognizes EF-P^Rha and immunodetection

这一成果近期发表在《Chemical Science》，文章的第一作者为第二军医大学博士研究生李翔和德国慕尼黑大学博士研究生Ralph Krafczyk。

该论文作者为：Xiang Li, Ralph Krafczyk, Jakub Macošek, Yu-Lei Li, Yan Zou, Bernd Simon, Xing Pan, Qiu-Ye Wu, Fang Yan, Shan Li, Janosch Hennig, Kirsten Jung, Jürgen Lassak*, Hong-Gang Hu*

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文)：

Resolving the α-glycosidic linkage of arginine rhamnosylated translation elongation factor P triggers generation of the first Arg^Rha specific antibody

Chem. Sci., 2016, 7, 6995-7001, DOI: 10.1039/C6SC02889F

参考文献：

1. Li S, Zhang L, Yao Q, Li L, Dong N, Rong J, Gao W, Ding X, Sun L, Chen X, Chen S, Shao F. Pathogen blocks host death receptor signaling by arginine GlcNAcylation of death domains. Nature., 2013, 501, 242–246.

2. Pearson JS, Giogha C, Ong SY, Kennedy CL, Kelly M, Robinson KS, Lung TW, Mansell A, Riedmaier P, Oates CV, Zaid A, Mühlen S, Crepin VF, Marches O, Ang CS, Williamson NA, O'Reilly LA, Bankovacki A, Nachbur U, Infusini G, Webb AI, Silke J, Strasser A, Frankel G, Hartland EL. A type III effector antagonizes death receptor signalling during bacterial gut infection. Nature., 2013, 501, 247–251.

3. Lassak J, Keilhauer EC, Fürst M, Wuichet K, Gödeke J, Starosta AL, Chen JM, Søgaard-Andersen L, Rohr J, Wilson DN, Häussler S, Mann M, Jung K. Arginine-rhamnosylation as new strategy to activate translation elongation factor P. Nat. Chem. Biol., 2015, 11, 266-270.

4. Pan M, Li S, Li X, Shao F, Liu L, Hu HG. Synthesis of and specific antibody generation for glycopeptides with arginine N-GlcNAcylation. Angew. Chem. Int. Ed., 2014, 53, 14517-14521.