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HIF化学探针VH298:突袭缺氧信号通路的特种兵

对需氧生物而言,氧气的重要性不言而喻,不过,总归有氧气供应不足的时候,这时的细胞会进行一系列的调整,来适应低氧水平环境。生物体内,存在缺氧诱导因子HIFs(hypoxia inducible factors)这个缺氧信号,它们是对氧气敏感的转录因子,包括对氧敏感的α亚基HIF-α(它们有同源三兄弟:HIF-1α、HIF-2α、HIF-3α)和结构稳定的β亚基(HIF-β)。在常氧状态下,HIF-α中氧依赖降解区域(ODD)多肽序列的脯氨酸被脯氨酸羟化酶(PHD)羟基化,然后被特异性E3泛素化连接酶(VHL)识别,再通过蛋白酶体途径降解,实际含量很低。而在缺氧环境中,HIF-α能躲过一劫,它与HIF-β组成异质二聚体后,与DNA部分组装为缺氧反应元素HREs(hypoxia response elements),从而启动缺氧响应,如血管再生、细胞增殖、葡萄糖摄取、厌氧代谢等一系列生理活动。


估计大家已经猜到了,这不是和肿瘤发展很类似嘛,确实很多实体肿瘤内部是缺氧环境,HIF过度表达。因此HIF-α对缺氧信号通路研究、验证候选药物、改进治疗方案等具有重要意义,但它在生物体内常氧条件下极不稳定,成为摆在科学家面前的一大困难。近来稳定HIF-α的化合物有缺氧模拟物如Fe2+、Co2+、Ni2+等离子、2-氧戊二酸盐模拟物、Fe2+螯合剂、PHD酶抑制剂和蛋白酶体抑制剂等,这些化合物的靶标选择性普遍较差,易影响多种信号通路,实际效果有限。近日,英国邓迪大学Alessio Ciulli等人独树一帜,他们新制备的HIF小分子化学探针VH298,封锁了VHL:HIF-α蛋白-蛋白相互作用,专一高效地稳定HIF-α,相关论文发表在Nat. Commun.上。

VH298和靶标的结合。图片来源:Ciulli Laboratory/ University of Dundee


Alessio Ciulli设计的VH298采用全新的机理,它封锁了VHL:HIF-α间的蛋白-蛋白作用。为避免重蹈“抑制蛋白间相互作用能力差导致无法在细胞内累积HIF-α”的覆辙,新抑制剂的竞争力要强过内源性的HIF-α亚基。


研究者们根据化合物VH032和VHL的共晶结构,设计了效果更好的VH298。与VH032相比,VH298用氰基环丙基代替了甲基,等温滴定量热法ITC测试Kd高达90 nM,竞争荧光偏振法测试Kd高达80 nM,配体效率达0.26,作为蛋白-蛋白作用抑制剂而言表现优秀。进行实时剂量依赖的相关性分析表明,VH298的kon = 6.47×105 M-1s-1koff =0.065s-1,说明形成VHL复合物的速度很快,解离很慢。

VH032和VH298的化学结构,以及VH298和VHL蛋白的共晶结构。图片来源:Nat. Commun.


VH298和VHL蛋白的结合与之前的VH032同出一辙,只是对VH298而言,氰基环丙烷结构更适合左手边口袋,环丙烷指向Arg69的脂肪链,氰基指向酰基的anti构象,此时结合能最小,见上图。VH298脯氨酸结构上的手性羟基具有重要作用,它的差向异构体cis-VH298没有活性。VH032、VH298与它们的差向异构体cisVH032、cisVH298的生物活性总结见下图。

化合物对VHL的结合常数、配体效率、渗透性和亲脂系数等。图片来源:Nat. Commun.


在生理pH下,细胞渗透性越高,化合物进入到细胞内部到达靶标的比例越大,VH298的渗透率为19.4 nms-1,高于VH032,意味着进入细胞中的抑制剂越多。另外毒性试验表明,150 μM甚至高达500 μM浓度的VH298都没有表现出细胞毒性。VH298的高渗透性和可以忽略的毒性,使其适用作为生物研究的化学探针。


热稳定性试验和定量质谱分析表明VH298的主要靶标是VHL,而对一百多种激酶、离子通道等都无活性。在HeLa细胞中,用10 μM VH298处理2小时后,即产生浓度依赖的HIF-1α 累积,并可产生可见的HIF-1α谱。使用免疫印迹法,VH298选择性稳定了羟基化的HIF-α,即HIF-α-OH,并使其无法被VHL识别降解。在骨肉瘤细胞系中,VH298增强了HIF的转录活性,在其他细胞中也能正调节HIF的靶标基因如CA9、GLUT1,表达它们对应的蛋白。此外,VH298还能刺激促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)的生成。这些试验都表明VH298作为一款优秀化学探针,有效引起了细胞内依赖HIF的缺氧反应。


Alessio Ciulli接收采访时说,缺氧信号可以引起一系列级联反应,不能简单的把缺氧定义为“好”或者“坏”。对癌症而言,缺氧信号能帮助肿瘤细胞生存和增殖;但同样也能用于治疗缺血性脑损伤和心脏损伤,包括中风慢性肾脏疾病或化疗引发的贫血等病症。控制缺氧信号通路,可以发现新的治疗方案。VH298的选择性非常高,它像特种兵一样“悄悄”突破细胞的防御系统,暗中控制缺氧信号通路。



—— 题外话 ——


有同学就有疑问了,这不就是个酶的抑制剂嘛,为啥还整个“化学探针”的名号?


广义上讲,探针是指能与特定的靶分子发生特异性相互作用的分子,并可以被特殊的方法所检测,抗原-抗体、配体-受体的相互作用都可以看作是探针与靶分子的相互作用。我们把背景放在药物发现这个领域,现代药物研发越来越依赖于靶标的发现,以及靶标与活性化合物作用模式。化学药物分子进入体内后,作用在靶标的特定部位,从而诱发生物化学或生理学的变化,产生药物效应,达到治疗目的。利用化学小分子的多样性,设计合成能够高选择性地探测蛋白质的功能、结构以及与作用模式的化学探针,可以为疾病的诊断和防治提供新的标记物、药物作用靶点和先导结构,从而为药物发现奠定基础。


原文(扫描或长按二维码,识别后直达原文页面):

http://www.nature.com/articles/ncomms13312

Potent and selective chemical probe of hypoxic signalling downstream of HIF-α hydroxylation via VHL inhibition

Nat. Commun., 2016, 7, 13312, DOI: 10.1038/ncomms13312)


部分内容编译自:

http://phys.org/news/2016-11-molecular-commando-tackle-hypoxia-pathway.html


Alessio Ciulli课题组主页:

http://www.lifesci.dundee.ac.uk/groups/alessio-ciulli/


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