通过计算机设计获得超广谱多肽C末端特异性修饰酶

注：文末有研究团队简介及本文科研思路分析

多肽的末端功能化对其生化性质具有非常重要的影响。通过对C端的特异性修饰可以使多肽的体内代谢半衰期延长、免疫原性降低或毒副作用减少。而在多肽的生化性质研究中，研究者往往需要将不同的功能化基团（例如，荧光基团、合成高分子或是免疫标记）添加到多肽结构中。此外，高效准确的多肽C端保护、去保护以及选择性活化方法，也是工业化多肽合成生产中所迫切需要的技术。因此，多肽的选择性C端修饰方法是当下生物活性大分子研究的热点领域，也是多肽的工业化生产中急需解决的问题。由于多肽结构的复杂性，化学修饰步骤多、产率低、难度很大。而酶法修饰具有高度的位置和立体选择性、几乎不需要额外的侧链保护和去保护、无消旋化副反应，因此具有极大的优势。从嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）中分离的一种多肽酰胺酶具有很好的潜力作为多肽C末端修饰酶，但是该酶的弱稳定性与窄修饰谱限制了其应用。

中国科学院微生物研究所吴边课题组与荷兰格罗宁根大学的Janssen教授、Feringa教授（2016年诺贝尔化学奖得主）以及Enzypep公司（帝斯曼基团子公司）合作，通过计算机设计获得了新一代的广谱多肽C末端修饰酶。首先作者采取了一种“高低结合”的计算策略对多肽酰胺酶进行了工程化改造。通过使用静态能量计算作为分子设计基础，结合动态分子动力学模拟进行虚拟筛选，作者成功设计了一个经过高度改造的多肽酰胺酶突变体PAM12A（包含12个突变点）。该突变体具有极高的热稳定性（熔解温度达到76 ℃），并且可以在乙腈、丙酮等多种无水溶剂环境中保持数天的稳定活性。因此该突变体可以在有机相中催化许多在水相中由于热力学或动力学限制而无法进行的反应。实验结果表明，PAM12A可以催化包括甲酯化、羟胺化、甲胺化、胺化在内的多种不同的多肽修饰反应，且不受多肽本身序列和C端原功能基团的限制。在成功尝试了数十种不同的短肽修饰后，作者还对药物多肽脑啡肽、胃泌素和舍莫瑞林进行了定点修饰，显示了该酶的实际应用潜力。

吴边研究员

上述研究成果已经在美国化学会ACS Catalysis（IF=9.874）在线发表，并被选为ACS EDITOR’S CHOICE重点推荐文章。该课题得到了中国科学院百人计划基金支持。

该论文作者为：Bian Wu*, Hein J. Wijma, Lu Song, Henriëtte J. Rozeboom, Claudia Poloni, Yue Tian, Muhammad I. Arif, Timo Nuijens, Peter J. L. M. Quaedflieg, Wiktor Szymanski, Ben L. Feringa, Dick B. Janssen*

http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acscatal.6b01062

Versatile Peptide C-Terminal Functionalization via a Computationally Engineered Peptide Amidase

ACS Catal., 2016, 6, 5405–5414, DOI: 10.1021/acscatal.6b01062

研究团队简介

吴边，中国科学院微生物研究所百人计划研究员，博士生导师，担任中国生物发酵产业协会理事，中国微生物学会酶工程专业委员会委员。主要从事工业酶的发掘应用与计算机模拟蛋白质设计方面的工作。在Angew. Chem., Trends. Biotechnol., ACS catalysis等国际著名刊物发表数十篇论文。注重基础研究与产业开发的结合，曾参与德国巴斯夫（BASF）、荷兰皇家帝斯曼集团（DSM）等跨国化工企业的项目开发，与国内多家企业也开展了联合研发工作，目前已经有多项技术实现商业转化与产业应用。

作者科研思路分析

Q：这项研究的最初目的是什么？或者说想法是怎么产生的？

A：Enzypep是荷兰帝斯曼集团下专业从事多肽的酶法合成的子公司。公司的主要核心技术是多肽片段的酶法组装技术。多个多肽片段在组装时，需要将C-端反复保护与活化，因此，项目初始时是想通过生物催化来获得不受序列限制的高位置选择性修饰方法。

Q：在研究中过程中遇到的最大挑战在哪里？

A：开始只是瞄准一个特异反应，随着研究的进行，我们发现这个系统可以做的事情太多了，因此需要做大量的各式反应来证明其可行性。

Q：本项研究成果最有可能的重要应用有哪些？哪些领域的企业或研究机构最有可能从本项成果中获得帮助？

A：该方法在合成多肽的过程中可以有应用，我们也在探索将多肽特异性标记的方法应用到蛋白质组学的研究中。除此之外，我们认为该技术可以在食物来源的功能多肽的改性方面有很大应用。目前药物多肽中有相当大部分是经过C-端修饰的，该修饰对多肽的生物活性有巨大影响。而食物来源的活性多肽是通过蛋白质酶切割大蛋白得到的，C-端只能是羧基。目前没有好的方法可以对C-端羧基进行修饰。我们的酶将有可能被应用于这些天然多肽的修饰改性，创造出具有更高生物活性或者长半衰期的多肽产品。

Q：其他想和读者们分享的

A：包括酶在内的蛋白质计算机设计这一新兴领域，在经过几年的发展后，目前已经处在从概念发展到实际工业应用的节点位置。希望我们的工作能够让更多的实验科学家认同这一突破性技术的进步和应用潜力。

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