天然产物研究新范例：从新颖结构到靶点确证

活性天然产物具有独特的生物相容性、新颖的结构骨架以及广泛的药理活性，时至今日依然是当今药物发现的一种重要手段。在天然产物研究学界，最具影响力的研究期刊莫过于Journal of Natural Products。通常，我们在这个期刊上读到的大量论文标题是这样的——“从XXX中分离得到了具有某某生物活性的某种结构类型的XXX A-J”，今天要向大家介绍这篇由意大利萨莱诺大学Nunziatina De Tommasi等人完成的论文，画风却别具一格，看一眼题目就知道这文章的闪光点——“Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) Identifies Laurifolioside as a New Clathrin Heavy Chain Modulator”。（J. Nat. Prod., 2016, DOI: 10.1021/acs.jnatprod.6b00627)

结构新颖的化合物是J. Nat. Prod.文章的基本要素。作者报道了从大戟属植物Euphorbia laurifolia分离得到的5个二萜新化合物（1-5）和一个单萜新化合物6。至于结构是不是非常新颖，贴出来大家一起品评吧。

图片来源：J. Nat. Prod.

结构解析部分咱们就不赘述了，包括DQF-COSY和1D-TOCSY在内的，您能想到的各种一维二维NMR手段作者都用上了。重点来了，天然产物的立体构型确定一直是个难点，以往大家都押宝于X-Ray单晶衍射技术，谁要是能将分离得到的一两毫克纯品养出单晶来，那绝对可以和师弟师妹吹个三年五载的。这些年，越来越多的学者选择用计算化学模拟ECD光谱和实际测得ECD光谱比较来确定化合物的立体构型。作者也使用了这种方法确定化合物1和2的立体构型。

图片来源：J. Nat. Prod.

寻找活性天然产物的直接作用靶点是非常困难的！非常困难的！非常困难的！（嗯，重说三！）但是呢，也不是完全无计可施，随着学科融合交叉发展还是有办法找到了一些作用靶点。比如，在活性化合物上接一些功能基团得到探针分子，再利用探针分子垂钓蛋白，结合生物质谱手段寻找作用靶点。这套方法目前相对成熟，也有一些成功案例，但是该策略最大的弊端就是需要对活性分子进行化学修饰。虽然通过活性评价可以证明修饰基团不影响活性，而且通过一些生物物理手段可以证明结合蛋白的片段是最初的活性化合物而不是引入的功能基团，但是，如果活性分子是结构复杂难以合成的天然产物，在自然界存在量又很低，那么对其进行化学修饰的难度可想而知。这样的活性天然产物该怎么找靶点呢？

图片来自网络

Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS)技术很好的解决了上述问题，其最大优势在于无需对活性分子进行任何化学修饰。我稍微科普一下，DARTS技术的基本原理是基于蛋白质的稳定性。文献报道，当蛋白质结合了小分子化合物后，其对蛋白水解酶的稳定性明显提高。直观地说，结合小分子的蛋白不容易被蛋白酶水解，这些蛋白就可以在电泳后被检测到，随后利用生物质谱可确定具体的靶点蛋白。

图片来源：PNAS

作者就是应用了这样的技术确定了laurifolioside (1)在PC-3和MCF-7细胞中的直接作用靶点是内涵素重链1（clathrin heavy chain 1）。

图片来源：J. Nat. Prod.

图片来源：J. Nat. Prod.

在获得靶点信息之后，验证活性分子与靶点的相互作用则是另一个难点。作者并没有选择小分子与蛋白相互作用的直接检测手段，而是根据内涵素介导的细胞内吞功能进行了间接检测。通过检测化合物影响细胞对转铁蛋白(transferrin)的内吞作用变化来反映化合物对内涵素的作用。实验结果间接佐证了laurifolioside对内涵素的抑制作用。

图片来源：J. Nat. Prod.

文末，作者应用分子动力学模拟与分子对接等计算化学技术推测了laurifolioside与内涵素的结合构象，氢键疏水键作用位点及结合能量。

图片来源：J. Nat. Prod.

整篇文章看完之后，个人感觉这篇文章最大特点就是“虚实结合”。立体构型的确定用到了计算化学虚拟ECD光谱与实测ECD光谱的比较；靶点寻找部分先是用了DARTS实验找到可能的靶点，再用分子模拟手段推测作用形式。毫无疑问，DARTS技术找靶点是这篇文章最大的闪光点。当然，如果后面的靶点验证选择直接检测相互作用的技术就更好了，如果有laurifolioside与内涵素的共晶结果就更好了，如果有……就更好了……如果我说的这些都有了，估计我们也就在J. Nat. Prod.上看不到这篇文章了。好吧，历史不能假设。瑕不掩瑜，客观的讲这篇文章的架构在近年的J. Nat. Prod.上并不多见，绝对算得上卓尔不群。不知道各位做天然产物的朋友们看着手里测活待发的新化合物们有没有心头一凉，虎躯一震。嗯嗯，还是赶紧解结构去吧，解析出来才好找人合作嘛。

http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.jnatprod.6b00627

PS: 我知道各位读者都很忙（懒），又对DARTS技术感兴趣，特奉上原始文献链接供大家学习。大伙要感谢的话就多多转发我的文章吧，希望我们的平台为更多朋友的工作学习带来帮助。

Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS).

http://www.pnas.org/content/106/51/21984.full.pdf

（本文由乐只君子供稿）