JACS：利用蛋白质自带导向基的定点分子手术

众所周知，蛋白质的翻译后修饰（PTM）对于增加蛋白质组的功能多样性，以及调节蛋白质亚基的水解或者整个蛋白质的水解至关重要，因此探索蛋白质翻译后修饰在细胞生物学以及疾病预防和治疗方面意义重大。大自然神奇之手让酶和底物相互作用相互识别，并毫无偏差的对蛋白质进行定点修饰，从而控制着功能开关的开启与关闭。人类之手能不能模仿进化了数亿年的生物化学修饰呢？近期，牛津大学Benjamin G. Davis小组在JACS上刊文用纯化学手段证明了这一策略的可行性。（Selective Metal-Site-Guided Arylation of Proteins. J. Am. Chem. Soc., 2016, 138, 8678-8681, DOI: 10.1021/jacs.6b04043）

图片来源：J. Am. Chem. Soc.

传统上对蛋白质化学修饰方法主要依赖于蛋白质上某一特定残基的化学选择性，比如赖氨酸的氨基或者半胱氨酸的巯基都具有一定的亲核性从而与某些亲电试剂加成。这种修饰方法简单粗暴所以会导致多位点修饰的副产物，如何对某一特定位点残基选择性修饰就是一个问题。一个常用的解决方法是利用酶或者化学方法将某些非天然氨基酸（UAA）导入到蛋白质特定位置上，这些非天然氨基酸带有具有“正交试验”活性的基团从而大大提高了化学选择性。虽然有报道利用非天然氨基酸侧链与金属的螯合来实现蛋白质的修饰，但利用蛋白质上天然存在的氨基酸残基作为导向基团进行特定位点修饰却鲜有报道（还记得小小僧之前报道的Cu催化的蛋白质定点N-H键活化么？点击这里阅读）。

图片来源：J. Am. Chem. Soc.

Davis小组的设计思路基于金属离子导向的蛋白质定点修饰，就像人的两只手，左手（金属离子）抓住蛋白质上特定具有螯合配体性质的位点（靶向性），右手（待修饰小分子化合物）与配体附近的氨基酸残基反应进行化学修饰（反应活性）。自然界中不乏用金属离子作为辅因子的酶（如红素氧还蛋白、过氧化物歧化酶等），作者选择用金属离子依赖性A类糖基转移酶（GTs）中的甘露糖基甘油酸合酶（MGS）作为模型系统。GT-A类酶有一DxD序列作为金属螯合位点，具体到MGS的位点为D₁₀₀A₁₀₁D₁₀₂，作者假设这三个位点可以被用作金属-芳基化合物的结合位点，继而将芳基转移到邻近的氨基酸残基（如233位半胱氨酸残基Cys₂₃₃）上。

说干就干，首先，作者用活性较高的碘苯作为待修饰小分子，并选用钯催化剂（水相反应活性较好）作为金属螯合剂，最终确定Pd(OAc)₂（并用DM-ADHP作为配体）效果最好（65 °C）。值得一说的是，大牛Buchwald去年也在Nature上报道过用钯催化剂对蛋白质半胱氨酸巯基进行芳基修饰（点击这里阅读）。LC-MS证明只有单取代修饰产物生成，用内消化酶水解蛋白质并用LC-MS/MS分析确定修饰位点位于233位半胱氨酸残基（Cys₂₃₃）。并没有影响其他位点的半胱氨酸残基（如Cys₃₄、Cys₂₀₉、Cys₃₀₅），特别是暴露出来的位阻较小的Cys₃₀₅并没有被修饰。

图片来源：J. Am. Chem. Soc.

接下来作者从各个方面证明了螯合位点和反应位点的缺一不可。首先，作者对其中的某些半胱氨酸突变成丙氨酸残基（C₃₄A、C₂₀₉A、C₂₃₃A），结果证明只有当233位Cys残基突变成Ala时（C₂₃₃A），没有修饰产物生成，说明反应位点只在Cys₂₃₃。另一方面，丙氨酸扫描突变分析技术（Ala-scanning mutational analysis）显示D₁₀₀、D₁₀₂以及T₁₃₉氨基酸残基对于金属离子螯合影响最大（虽然不是全部），证明了导向氨基酸残基部位对于定点修饰的重要性。

得到这些证据后，作者扩大了待修饰小分子底物范围，结果显示对各种芳香环的兼容性都很好，如带有click把手的化合物12、13；带有生物素把手的化合物14，这对于后期的荧光检测或者亲和色谱分离都非常具有优势。

图片来源：J. Am. Chem. Soc.

最后，作者用此方法在细胞裂解液钓出了另一条大鱼——chaperonin GroEL（用带有生物素的芳基化合物14），此酶参与蛋白质生物合成的最后几步，并已知此酶的天冬氨酸残基部分参与Mg离子的结合而发挥作用。

小小僧点评：

1）成果很漂亮，证明了蛋白质的金属离子结合位点可以作为化学修饰的导向基团，具有很高的特异性，工作做得非常完善。2）是否只能用于某些特定蛋白质（具有金属离子螯合位点）的检测、分离？3）反应条件是否需要进一步优化？毕竟不是所有蛋白质在65°C都能稳定。

Davis小组主页：http://users.ox.ac.uk/~dplb0149/people/bdavis.html

http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jacs.6b04043

（本文由扫地小小僧供稿）