细胞和活体中酪氨酸酶的实时成像

酪氨酸酶是一种重要的酚羟基氧化酶，广泛存在于植物、动物和微生物体中，是黑色素代谢过程中的关键酶之一。据报道，酪氨酸酶在黑色素瘤细胞中过量表达，所以在临床研究中可以作为一种黑色素瘤的生物标记。因此，构建一种可应用于活体酪氨酸酶快速检测的方法在生命科学及医学临床研究中具有重要意义。目前检测酪氨酸酶的方法有很多种，如电化学方法、荧光法等。但是无论是电化学的方法还是荧光的方法都会引入外源的刺激（电或者光），不能做到真正的非侵入性检测。生物发光是一种存在于生物体内特殊类型的化学发光，不依赖于有机体对外界光能的吸收，而是生物体内的荧光素类物质在荧光素酶、氧气、ATP和镁离子等共同作用下将化学能转化为光能的过程。生物发光成像技术具有非侵袭性、低背景、高灵敏度、可视化以及能够实现实时动态观测等优点，近年来备受关注，逐渐发展成为一种重要的活体成像手段。

最近，中国科学院化学研究所的杨国强研究员（点击查看介绍）团队利用3-羟基苄基作为酪氨酸酶识别基团，结合生物发光技术设计合成了一种新型的生物发光探针（TYR-LH₂），该探针可完成对细胞和活体中酪氨酸酶的实时成像。

该生物发光探针与传统荧光探针相比，具有不需要激发光源、背景信号低、高灵敏度等优点，不仅可以用于选择性和灵敏地检测和区分不同类型的细胞中酪氨酸酶浓度的变化，还可以用于对负载黑色素瘤小鼠体内酪氨酸酶的检测。在0-200 U/mL的酪氨酸酶浓度范围内，该探针的生物发光强度和酪氨酸酶的浓度之间存在良好的线性关系，检测限可低至0.11 U/mL。体外实验表明，TYR-LH₂对酪氨酸酶有很高的灵敏度，并且不受其他活性氧物种的干扰。在细胞实验中，该探针表现出对内源性酪氨酸酶的实时响应，可成功区分黑色瘤细胞与正常细胞；进一步的活体成像证明该探针可用于评估小鼠体内转移瘤中酪氨酸酶的过量表达。

图1.（a）探针对不同浓度酪氨酸酶的生物发光响应；（b）探针与酪氨酸酶作用的生物发光强度与时间的关系；（c）探针与酪氨酸酶及各种活性氧物种作用的生物发光响应；（d）探针作用于不同种类细胞的生物发光强度与探针浓度的关系。

图2. 探针对接种B16-luc细胞的小鼠体内酪氨酸酶的生物发光成像。

以上结果为将TYR-LH₂发展成为一种可用于黑色素瘤临床检测及药物筛选的可视化工具提供了良好的实验基础。这一成果发表在Analytical Chemistry 上，文章的第一作者是中国科学院化学研究所的博士研究生李双，该工作也得到国家自然科学基金的大力支持。

该论文作者为：Shuang Li, Rui Hu, Shuangqing Wang, Xudong Guo, Yi Zeng, Yi Li, and Guoqiang Yang

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Specific Imaging of Tyrosinase in Vivo with 3-Hydroxybenzyl Caged D-Luciferins

Anal. Chem., 2018, DOI: 10.1021/acs.analchem.8b01874

杨国强研究员简介

杨国强，中国科学院大学副校长，中国科学院化学研究所研究员；1985年毕业于北京大学化学系，获理学学士学位；1991年毕业于中科院感光化学所，获得理学博士学位；日本学术振兴会（JSPS）博士后研究员（1992年至1993年，京都大学）、美国依利诺伊大学（UIUC）化学系博士后/研究助理（1996年至1999年）、法国阿尔萨斯大学（Ecole Nationale Superieure de Chimie de Mulhouse, Universite de Haute-Alsace）高级访问学者（1995年、2001年、2003年）。

杨国强的研究领域是在有机光功能化合物的设计、合成、性能及其作用机理方面开展研究工作，包括分子结构对发光性质和非线性光学性质的影响、光化学荧光探针（包括用于生物体系的荧光探针）、环境条件（包括超高压条件）对材料性质和电子结构的影响及其作用机理、超高精细光刻胶和气凝胶材料等；在我国首先开展了极端高压条件下光功能材料的性质研究，发现并证明了三芳基硼化合物的双激发态荧光发射性能，提出了利用三芳基硼化合物作为新型多功能荧光探针的作用机理和应用开发；在我国首先开展了基于分子玻璃超高分辨光刻胶的研究，研发出用于极紫外（EUV）和ArF光刻(193 nm)的超高分辨光刻胶；在工业化工艺研发方面，开发了气凝胶的新型制备工艺和应用；在包括Angew. Chem. Int. Ed.、J. Am. Chem. Soc.、Nat. Commun.、Chem. Commun.、Anal. Chem.等学术刊物上发表研究论文220余篇，获得授权发明专利19项（包括日本专利1项和美国专利2项），另有申请专利15项。

http://www.x-mol.com/university/faculty/15448

科研思路分析

Q：这项研究最初是什么目的？或者说想法是怎么产生的？

A：我们实验室主要从事有机光功能材料的分子设计、合成、性能及其作用机理方面的研究工作，其中也包括生物发光探针的设计及在分子成像方面的工作。我们在实验过程中发现，由于传统的酪氨酸酶识别基团很容易受到活性氧物种的干扰，由此影响检测结果的准确性。我们就想寻找一种可以避免活性氧物种干扰的酪氨酸酶识别基团，再利用生物发光方法，结合新基团发展一种生物发光探针，既能避免荧光探针的一些不足，如需要激发光源、背景信号高等，又能避免活性氧物种的干扰，提高检测准确性。

Q：研究过程中遇到哪些挑战？

A：该研究中最大的挑战是探针在细胞和小鼠体内的应用。我们实验室主要从事光功能材料的分子设计、合成、性能及其作用机理方面的研究工作，虽然在常规细胞实验方面也做了大量工作，但研究的生物过程都相对简单，而且在活体中的应用也比较少。为了将探针应用于活体内，我们也做了大量的功课，通过实验室学生和老师的共同努力，最终很顺利地将探针应用于小鼠体内。

Q：该研究成果可能有哪些重要的应用？哪些领域的企业或研究机构可能从该成果中获得帮助？

A：该工作描述的生物发光探针TYR-LH₂可以作为一种潜在的用于观察与诊断黑色素瘤以及与酪氨酸酶过量表达相关疾病的工具。这种探针在生物发光标记与成像领域的企业或研究结果应该有较好的应用前景。