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腊八蒜,你为啥脸儿绿了?

太长不看版】经过低温储藏的大蒜,积累了大量含硫的家伙们(烷基半胱氨酸亚砜)。醋的加入使得大蒜细胞组织结构通透性增加,含硫的家伙们遇到了蒜酶(大蒜中的一种酶),并在其催化下转世为新的含硫的家伙(丙烯基硫代亚磺酸酯、蒜素等含硫化合物),以及丙酮酸(有没有勾起高中生物的回忆?)。新的含硫的家伙与不同氨基酸反应生成多种吡咯羧酸(没有颜色但是快要变色的家伙)。吡咯羧酸碰到丙酮酸反应生成黄色物质,碰到蒜素则反应生成蓝色物质。蓝色物质和黄色物质混合便产生了绿色。


腊八蒜是一种北方的传统小吃,传统的习俗是在腊月初八这天开始泡制,当然,为了能更早的吃上腊八蒜,提前开始腌制也是可以的。腊八蒜有着晶莹碧绿的蒜瓣,看着十分诱人,可对于第一次见到的人来说,可能反而被这绿色给吓一跳,甚至发出“哎呀这蒜是不是坏了啊”,“泡蒜的醋有问题吧”等疑问。或许有人会奇怪,腊八蒜这么常见,会有人不认识吗?其实,经过一段时间的冷藏后再用醋泡,才能泡出绿色的腊八蒜。无怪乎在过去,只有在有着寒冷冬季的北方,才能制出这样的翠绿腊八蒜。

图1. 嫩青碧绿的腊八蒜,似乎少了饺子的陪伴


腊八蒜固然好吃,可挡不住有求知欲的人喜欢刨根问底:这绿色到底是什么,是叶绿素?是花青素?绿色又是怎么来的呢?


这还真是一个难题。大蒜有着悠久的被吃的历史,它的变绿也早已受到关注,因为大蒜制品如蒜泥会因为变绿而影响卖相。然而,其中的原因仍然没有彻底弄清。而腊八蒜变绿的相关研究就更少了。尽管如此,循着前人的足迹,还是可以对腊八蒜变绿背后的故事一探究竟。


目前,对于大蒜制品变绿的过程,普遍认为经过两个阶段。经过切磨等处理(如制作蒜泥),大蒜制品中细胞内各物质得以接触混合,首先是大蒜中丰富的含硫化合物,烷基半胱氨酸亚砜在蒜酶(Alliinase)的催化下生成硫代亚磺酸酯,之后和各种氨基酸发生非酶促反应,生成具有绿色的物质。1么腊八蒜呢?2005年,在最早关于腊八蒜变绿原因的研究中,2研究者首先用乙酸溶液(最纯正的白醋啊)制备了腊八蒜(不是为了吃)并监测了变色的过程。通过紫外可见吸收光谱可以看出,随着腌制时间的延长,对应于440纳米和590纳米的吸收峰在逐渐增长,而这两个波长对应颜色的吸收正好分别对应着黄色和蓝色的显现。另外一个有趣的现象是,随着时间的推移,黄色物质的浓度增长明显快于蓝色物质的。有经验的读者会发现,这和我们日常生活中腌制腊八蒜的现象是一致。有时候腊八蒜腌得太多吃不完,时间久了就会慢慢由绿色变为黄褐色,这就是因为黄色物质积累远远快于蓝色物质造成的。

图2. *乙酸溶液腌制大蒜得到的腌制溶液随时间变化的紫外可见吸收光谱:(a) 45天,(b) 25天, (c) 14天,(d) 11天,(e) 7天,(f) 5天,(g) 4天。


尽管颜色都是绿的,要证明腊八蒜的变绿和其他蒜制品的变绿是一回事儿,还需要更多的证据。在关于蒜制品变绿的研究中,比较明确的是大蒜变绿需要蒜酶参与其中。于是,研究者又在制备腊八蒜的过程中,分别添加了乙醇(蒜酶的变性剂,使其失去活性)和羟胺(蒜酶的抑制剂,还是跟蒜酶过不去的家伙),这回真的吃不上腊八蒜了。不过值得高兴的是,随着乙醇或者羟胺浓度的增加,蓝色物质的生成量大大降低了,这在一定程度上支持了腊八蒜的腌制需要蒜酶参与这一结论(严格的来说,需要证明乙醇和羟胺不会影响除了蒜酶以外的物质或过程,才能更好的证明是因为蒜酶的变性剂/抑制剂导致了绿色无法生成)。


而另外一个与大蒜制品变绿有关的指数,是硫代亚磺酸酯的含量。因为大蒜制品的变绿需要硫代亚磺酸酯参与形成绿色物质,因此,对腊八蒜腌制过程中硫代亚磺酸酯含量的监测也可以对变绿机理的揭示有所助力。随后的实验表明,随着腌制时间的延长,硫代亚磺酸酯的含量也在下降,而与此同时,色素有着相对应的增长。此外,加入半胱氨酸可以抑制大蒜的变绿,3这是由于半胱氨酸可以和硫代亚磺酸酯反应,4使其无法参与后续生成绿色物质的过程。同样的,在制备腊八蒜时,随着半胱氨酸加入量的增加,色素的产生也显著下降。这也从另一面表明了腊八蒜的变绿和大蒜制品变绿的原因很可能是一样的:乙酸加入后,大蒜细胞的通透性改变,起到了切磨大蒜的作用,各物质进而接触发生反应,形成绿色物质。


那么,这黄色和蓝色,到底是对应着什么样的物质呢?也许有人会说,最容易想到的就是对应两种物质,一个黄色,一个蓝色呗。目前主流的观点也的确认为是对应了黄色和蓝色的物质,只不过不是一种,而是一类,而且这两种颜色之间存在转化。将腌制大蒜的溶液放置数天可以观察到如图3所示的变化,蓝色在不断减少,黄色在不断增加,而且还可以观察到近似等消光点,这表明蓝色物质转化为了不止一种黄色物质。2

图3. 腌制腊八蒜溶液的紫外可见吸收光谱随时间变化图:(a) 2天,(b) 3天,(c) 5天,(d) 7 天,(e) 8天。


综合前人对于大蒜变绿的研究,研究者对于腊八蒜变绿的可能过程进行了一个初步的整理:首先,烷基半胱氨酸亚砜在蒜酶和乙酸的作用下生成硫代亚磺酸酯,之后再与氨基酸等物质反应生成黄色和蓝色物质,其中蓝色物质可以慢慢转化为黄色物质(图4)。

图4. 腊八蒜变绿机理的初步推测。


当然,对于绿色物质是否为黄色物质和蓝色物质的组合,也有不同的观点,即认为绿色物质是单一的组成,同时拥有两种吸收。比如在后续的一项研究中,有研究者从变绿的大蒜里通过一系列柱层析等分离手段,尝试提纯得到了一种绿色物质,并且通过质谱和核磁共振对其组成进行分析。5遗憾的是,他们并没有得到更明确的信息来确定其组成结构。目前多数研究的结果还是支持黄色和蓝色两类物质混合产生绿色的机制。


腊八蒜变绿的过程已经有了一个概貌,但是对黄色和蓝色的物质分别是什么这个问题,还是没有解答。既然之前的研究表明,烷基半胱氨酸亚砜可以被蒜酶催化转化为硫代亚磺酸酯,继续和氨基酸等物质反应生成色素,那么能否人为地将这些原料混合起来,在试管烧杯中制造这样的绿色呢?


在2006年一项研究中,6研究者将丙烯基半胱氨酸亚砜(烷基半胱氨酸亚砜中的一种,1-PeCSO)和蒜酶混合得到丙烯基硫代亚磺酸酯(这里把它归为一种显色剂,color developer)后,再加入氨基酸(缬氨酸或者丙氨酸),可以得到一种无色的物质,二甲基吡咯基羧酸。在这里,二甲基吡咯基羧酸是一种色素前驱体(Pigment precursor),因为吡咯基羧酸是没有颜色的,但是在加入蒜素(Allicin,由烯丙基半胱氨酸亚砜(2-PeCSO)经蒜酶催化转化而得,)后,可以转变成一种淡紫红色的物质。经过结构表征,可以发现这种淡紫红色的物质通过蒜素将吡咯基羧酸交联,有着较大的共轭结构。研究者猜测,随着交联的进一步增加,共轭范围增大,产物的颜色可能会向蓝绿色移动(图5)。

图5. 模型反应中形成色素的机理推测


2008年,有研究将六种吡咯羧酸作为模型反应物进行了研究,其结构如图6所示。7

图6. 之前提出的两种二甲基吡咯酸酸(顶部)和新的六种吡咯酸酸(底部)的结构。其中R基团代表对应的氨基酸种类。


研究者发现,将吡咯羧酸与新收获的大蒜(也就是没有经过低温储藏)混合泡制7天后,的确能得到绿色的产物,而且随着吡咯羧酸浓度的增加,绿色也更明显。其中以吡咯基甘氨酸变色最为显著。而将同样批次的大蒜分别与浓度相当的乙酸溶液、吡咯溶液或者吡咯加对应氨基酸的溶液混合泡制,都没有出现变色的反应(图7)。

图7. 不同方式泡制新收获大蒜7天得到结果的照片(A);不同方式的泡制溶液的紫外可见吸收光谱(B)。其中:(a)乙酸溶液或吡咯溶液或吡咯加相应氨基酸溶液泡制,(b)1 mmol/L P-Gly泡制,(c) 2.5 mmol/L P-Gly泡制,(d) 5 mmol/L P-Gly泡制,(e) 10 mmol/L P-Gly泡制。


这些结果说明,单纯的吡咯以及氨基酸,并不能起到产生颜色的作用。而之前用醋可以泡出绿色的腊八蒜,这次为什么不行了呢?这里要注意研究者使用了新收获的大蒜。由于新收获大蒜没有经过低温处理,所以没有积累足够的烷基半胱氨酸亚砜,即使在分别有乙酸、吡咯或者吡咯加氨基酸的条件下,也无法进一步生成色素(图7. a)。而对于这样的新兵蒜,人为加入吡咯羧酸,就可以跳过从烷基半胱氨酸亚砜生成吡咯羧酸的步骤,从而出现绿色素(图7. e)。更进一步地,研究者发现将吡咯羧酸和丙酮酸(Pyruvic acid,1-PeCSO和2-PeCSO在蒜酶作用下分解都会生成丙酮酸,见图8中step 1和step 3)反应可以得到黄色物质,而吡咯羧酸和蒜素反应可以得到蓝色物质,这也与之前研究的结果,也就是绿色物质由黄色和蓝色组成是相符的。研究者也进一步细化了大蒜生成绿色物质的推测机理示意图(图8)。

图8. 大蒜变绿推测的机理示意图。


至此,似乎腊八蒜变绿之谜只差临门一脚,只要把蓝色物质和黄色物质分别确定就可以了。在2009年,有研究进一步将吡咯羧酸和丙酮酸反应,并且对黄色产物进行了分离,通过质谱进行了结构的推断表征(图9)。8一年后,该研究组在之前的研究基础上,得到了一种增加两个甲基的黄色物质,将黄色色素的可能成员增加了一个(图10)。9

图9. 分离表征的三种黄色物质及其可能的形成过程。

图10. 黄色色素的新增成员。


至于蓝色色素这边,在2009年出版的一本关于大蒜和葱属植物的书中,作者提到了吡咯羧酸和蒜素反应生成蓝色至蓝绿色物质的可能途径。10从结构可以看出,生成的蓝色物质和之前提到的黄色物质结构比较接近,这也比较符合蓝色物质可以进一步向黄色物质发生转化的实验观察。

图11. 蓝色物质可能的生成途径。


腊八蒜变绿之谜似乎有了一个相对完整的解释,绿色既不是叶绿素也不是花青素,而是由硫代亚磺酸酯与氨基酸反应生成吡咯羧酸后,进一步分别与丙酮酸和蒜素反应生成黄色和蓝色物质混合而成。而实际上,由于模型反应和生物实体内肯定存在一定差别,并且大蒜中绿色物质的分离鉴定还没有一个明确的定论,在进一步确定黄色和蓝色物质的组成和形成机理上,显然还有很多路要走。无论如何,在探究变绿原因的路途中,人们发现了诸如将蒜储存在常温(23℃)之后再制作蒜泥等方法,以防止蒜制品变绿;11而相对的,为了使腊八蒜变绿更加容易,可以使用密相二氧化碳(Dense phase carbon dioxide)处理,更快更好的得到绿色的腊八蒜,方便食品工业生产。12对小小一片大蒜的研究,固然不能引领我们通往星辰大海,却也坚实地丰富着我们的物质生活,解答着我们的疑惑。


在这腊八佳节,端上一盘热腾腾的饺子,佐以腊八蒜变色的秘密,不知腊八蒜是否更有滋味?

图12. 腊八饺子一相逢,胜却人间无数。13


参考文献:


1) Kubec, R.; Hrbacova, M.; Musah, R. A.; Velisek,J. J. Agric. Food Chem. 2004, 52, 5089.

2) Bai, B.; Chen, F.; Wang, Z.; Liao, X.; Zhao, G.; Hu, X. J. Agric. Food Chem. 2005, 53, 7103.

3) (a) Kim, W. J.; Cho, J. S.; Kim, K. H. J. Food Qual. 1999, 22, 681. (b) Jiang, Y.; Hu, X.; Xin, L.; Liu, Y. Food Sci.2001, 22, 55.

4) (a) Han, J.; Lawson, L.; Han, G.; Han, P. Anal. Biochem.1995, 225, 157. (b) Miron, T.; Rabinkov, A.; Mirelman, D.; Weiner, L.; Wilchek, M. Anal. Biochem.1998, 265, 317. (c) Rabinkov, A.; Miron, T.; Mirelman, D.; Wilchek, M.; Glozman, S.; Yavin, E.; Weiner,L. Biochim. Biophys. Acta 2000, 1499, 144.

5) Lee, E.-J.; Cho, J.-E.; Kim, J.-H.; Lee, S.-K. Food Chem. 2007, 101, 1677.

6) Imai, S.; Akita, K.; Tomotake, M.; Sawada, H. J. Agric. Food Chem.2006, 54, 843.

7) Wang, D.; Nanding, H.; Han, N.; Chen, F.; Zhao, G. J. Agric. Food Chem. 2008, 56, 1495.

8) Wang, D.; Yang, X.; Wang, Z.; Hu, X.; Zhao, G. Food Chem.2009, 117, 296.

9) Wang, D.; Li, X.; Zhao, X.; Zhang, C.; Ma, Y.; Zhao, G. Eur. Food. Res. Technol. 2010, 230, 973.

10) Block, E. Garlic and other Alliums: The Lore and the Science. Royal Society of Chemistry: London, 2009.

11) Lukes, T. M. J. Food. Sci. 1986, 51, 1577.

12) Tao, D.; Zhou, B.; Zhang, L.; Hu, X.; Liao, X.; Zhang, Y. J. Sci. Food. Agric. 2015. DOI: 10.1002/jsfa.7463.

13) 图片来源:http://chihe.sohu.com/20150227/n409183101.shtml


(本文由 冬鼠包 供稿)


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