利用生物合成非天然氨基酸实现位点特异性蛋白质标记的平台

蛋白质特定位点的修饰对于其生物学和医学的应用非常重要。比如用荧光基团修饰可以追踪蛋白质的定位和动态变化，用药物修饰可以制备靶向杀伤癌细胞的抗体药物偶联体。为了实现对蛋白质的精准修饰，在蛋白质里定点引入一个可以结合修饰分子的生物正交元件非常关键。现在的研究可以用化学合成和生物合成的方法来制备被定点修饰的蛋白质，但是用化学合成方法制备大蛋白和进行基于细胞的蛋白质标记却很有挑战性。生物合成可以通过基因手段在蛋白质中引入一个非天然氨基酸来克服这些限制。在改造过的tRNA 合成酶/tRNA对的帮助下，具有生物正交反应基团的非天然氨基酸可以加载到蛋白序列中无义密码子对应的位置。但是，这种定点修饰的方法需要在培养基中加入化学合成的非天然氨基酸，限制了这种方法的应用。

为了克服上述问题，莱斯大学的Han Xiao教授（点击查看介绍）和他的团队巧妙地利用了近期被报道的大肠杆菌生物合成有苯胺侧链非天然氨基酸的基因通路，以及苯胺的良好生物正交反应性质，开发了一个汇集了苯胺侧链非天然氨基酸生物合成、定点加载到蛋白、蛋白和功能分子结合的平台。他们用这个平台实现了对anti-HER2 ScFv的荧光修饰，并且通过对HER2 阳性细胞的检测证明了这个平台的功效以及潜在的应用性。

图1. 利用生物合成非天然氨基酸实现蛋白标记的平台。

他们首先利用绿色荧光蛋白对于对氨基苯丙氨酸（pAF）的生物合成以及加载在蛋白的过程进行了优化。他们通过改造质粒载体提高了pAF加载到蛋白序列的效率，然后比较了不同pAF生物合成通路以及蛋白表达条件对于带有生物合成pAF的绿色荧光蛋白产量的影响。利用优化后的条件，带有生物合成pAF的绿色荧光蛋白产量可以达到1 mg/L。

为了证明生物合成的pAF可以作为正交元件来对蛋白进行定点修饰，他们选择了anti-HER2 ScFv 作为研究的蛋白。HER2 是一些乳腺癌和卵巢癌细胞膜上高表达的蛋白。Anti-HER2 ScFv是用来输送生物活性分子到这些癌细胞的融合蛋白。他们先是用SDS-PAGE和ESI-MS表征了含有生物合成pAF的anti HER2 ScFv，然后这个改造蛋白和2-氨基-4-甲基苯胺的反应证实了生物合成pAF的生物正交反应性。

然后，anti-HER2 ScFv和荧光分子结合体的制备和功能测试进一步证明了这个平台的应用。如下图a所示，anti-HER2 ScFv可以与带有红色荧光基团的2-氨基-4-甲基-苯胺反应。考马斯亮蓝染色和荧光SDS-PAGE以及ESI-MS证实了结合体的产生。令人兴奋的是，HER2高表达癌细胞（SK-BR-3）的靶向性实验证明了anti-HER2 ScFv和荧光分子结合体的生物学活性。这也进一步说明了这个平台在用生物合成的pAF修饰蛋白的同时，不会影响蛋白自身生物学性质的特点。

图2. 罗丹明B标记的anti-HER2 ScFv的制备和表征。

相关研究发表在Chemical Communications 上，第一作者为莱斯大学博士生Yuda Chen。

该论文作者为：Yuda Chen, Axel Loredo, Aviva Gordon, Juan Tang, Chenfei Yu, Janett Ordonez, Han Xiao

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Noncanonical Amino Acid-based Relay System for Site-specific Protein Labeling

Chem. Commun., 2018, 54, 7187-7190, DOI: 10.1039/C8CC03819H

研究团队简介

Han Xiao教授本科毕业于中国科学技术大学化学系，师从龚流柱教授。研究生毕业于Scripps化学系Prof. Peter G. Schultz实验室，随后在斯坦福大学化学系Prof. Carolyn R. Bertozzi实验室从事博士后研究工作。其相关研究工作分别以第一作者身份发表在 PNAS, JACS, Angew等期刊，共发表共同作者文章及专利20多篇。2017年，Xiao教授加盟全美顶尖私立大学莱斯大学（Rice University）。课题组研究方向包括：生物正交化学反应、蛋白质化学修饰、蛋白进化、抗体偶联、化学生物学以及相关交叉学科。

欢迎具有相关背景的英才联系加盟。实验室主页：http://xiao.rice.edu

Yuda Chen本科毕业于南京大学生物系，硕士毕业于密歇根大学药理系，现为莱斯大学化学系一年级博士生。

Han Xiao

http://www.x-mol.com/university/faculty/49804