基于喷墨打印技术的在线液滴数字PCR方法

重大疾病的形成是一个极其复杂的过程。许多情况下，从健康到疾病是一种由量变到质变的过程。如果这些病变可以在早期的单分子水平获得检测，大多数情况下都可以找到更为有效的治疗方法，对于提高患者的存活率具有重要的意义。然而，复杂的细胞环境中发生变异的分子丰度通常较低，需要在检测和分析之前进行扩增。因此，建立一种高效快速的数字PCR扩增技术将在生命科学领域具有广阔的应用前景。

近日，清华大学的林金明教授团队与首都大学东京（Tokyo Metropolitan University）的内山一美教授团队合作报道了一种基于喷墨打印技术的在线液滴数字PCR方法，通过喷墨打印技术产生可控大小的液滴，使每个液滴反应单元至少包含1个拷贝分子；随后将液滴以稳定分散体的形式引入毛细管连续流动式的PCR扩增系统；最后通过激光诱导荧光检测器对扩增后的液滴进行荧光信号的检测和计数。这种方法显著降低了实验试剂的样品量，并避免发生样品污染，提高了实验操作的简易性，为在线全自动化的数字PCR提供了新的方法。相关工作发表在Analytical Chemistry 上，文章的第一作者为清华大学的在站博士后张炜飞博士。

图1. 基于喷墨打印技术的数字PCR系统。

基于这一技术，作者首先采用喷墨打印技术，通过控制调节驱动电压和脉冲时间就能完成不同大小液滴的需求，并在短时间内产出。他们进一步通过优化液滴的进样频率，稳定两个液滴之间相应的间距，避免高频率液滴的产生导致PCR扩增过程中发生液滴融合和连接。与此同时，为了实现有效的DNA分子扩增效率，作者构建了连续流动性的毛细管PCR扩增体系，每个PCR循环的反应时间由单分散液滴通过毛细管的流速决定。而在毛细管中，流动相的温度近似于毛细管壁的温度。此外，液滴具有较大的比表面积，因此可以提高传热效率，并保证液滴内DNA的扩增效率。

图2.（A）喷墨打印液滴技术的示意图；（B）液滴进样频率对液滴间荧光信号分辨率的影响；（C）PCR循环扩增的示意图；（D）液滴的运转速率。

为了验证该方法的可靠性，他们选择对Caski细胞中的HPV序列进行定量分析，对不同浓度的样品，优化相适应的大小液滴，成功使单个液滴中包裹至少1个DNA拷贝分子，通过荧光信号计数每组中阳性液滴的数量，并基于泊松分布计算DNA模板的浓度。该方法实现了一种全自动化、成本低、易操作、连续在线无污染、试剂用量少的特点，且利于多种群体使用。作者相信该技术有望在生物和化学多个领域得到广泛的应用。该工作得到国家自然科学基金委（214350002和21621003）和国家重点研发项目的资助（2017YFC0906800）。

图3. 不同样品浓度的阳性液滴荧光信号图。

该论文作者为：Weifei Zhang, Nan Li, Daisuke Koga, Yong Zhang, Hulie Zeng, Hizuru Nakajima, Jin-Ming Lin, Katsumi Uchiyama

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Inkjet Printing Based Droplet Generation for Integrated Online Digital Polymerase Chain Reaction

Anal. Chem., 2018, 90, 5329, DOI: 10.1021/acs.analchem.8b00463

导师介绍

林金明

http://www.x-mol.com/university/faculty/12012