细胞膜蛋白超灵敏定量新技术

定位于生物膜的蛋白质分子是联系“细胞王国”与胞外环境的一类极为关键的生物功能分子，在物质运输、细胞通讯、能量代谢、胞内信号转导等细胞过程中扮演着重要的角色，因此对膜蛋白定量分析的重要性不言而喻。然而，由于膜蛋白通常具有疏水结构域、相互作用的异质结，而且存在于复杂的周边环境，因此，对膜蛋白进行定量往往需要繁琐而复杂的前处理，如膜蛋白的分离、提纯等，从而给日常的科学研究及实际应用增加了很多工作量。此外，对于低丰度膜蛋白的定量分析，一些常用的分析方法往往在灵敏度方面不能满足要求。

近日，南京大学的李根喜教授（点击查看介绍）课题组转变思路，省去了常规的分离、纯化步骤，提出一种细胞膜蛋白定量的新技术，即直接利用简便的基于核酸扩增的原位分析方法对膜蛋白进行定量，而且实现了极高的灵敏度。该技术是一种基于原位DNA滚环扩增为模板的信号放大策略（in situ rolling cycling replication-templated amplification, isRTA）（如图1），以“原位标记-滚环扩增-循环再放大”的方式进行，第一轮扩增的产物为第二轮信号放大提供模板，实现了两轮级联的核酸原位等温扩增反应，由此被标记膜蛋白的定量信号得以显著增强，细胞膜蛋白得以超灵敏量化。

图1. isRTA策略：核酸探针及引物（AP）的标记；DNA滚环扩增（RCA）；基于滚环扩增的二次信号放大（RTA）

李根喜教授等人进一步利用该技术，选取细胞上的一组膜蛋白进行定量分析，以对不同类型的细胞进行区分和识别。在该工作中，他们将一系列肿瘤相关的标志物（MUC1、EpCAM和HER2）进行量化（如图2），结果表明这些标志物在不同类型的乳腺癌细胞中分布，从而实现了乳腺癌细胞亚群的精确分型。

图2. 基于isRTA的多种细胞膜蛋白定量及“色域法”的细胞分型。选取的一组代表性膜蛋白（MUC1、EpCAM和HER2）被定量，随后进行归一化及RGB编码，由此每一种细胞就可以在色域图中找到其定置，实现细胞分型。

该技术的优势主要包括：生物相容性和良好的等温反应性；将膜蛋白的测定转化成对核酸的测定，且由核酸组装、切割循环放大获得很强的信号放大能力。两者结合为膜蛋白的定量分析提供了新的思路，降低了实验的复杂性，并可得到超高的灵敏度。这一成果近期发表在Analytical Chemistry 上，文章的第一作者是博士研究生高涛（现于上海大学从事博士后研究），研究工作得到了国家自然科学基金重点项目的支持。

该论文作者为：Tao Gao, Bei Wang, Liu Shi, Xiaoli Zhu, Yang Xiang, Jun-ichi Anzai, Genxi Li

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Ultrasensitive Quantitation of Plasma Membrane Proteins via isRTA

Anal. Chem., 2017, DOI: 10.1021/acs.analchem.7b02025

李根喜教授简介

李根喜，南京大学教授，博士生导师，国家杰出青年基金获得者；1984～1994年在南京大学化学系高分子化学、分析化学专业学习，分别获学士、硕士和博士学位；1994年6月在该校生化系从事博士后研究，1996年5月出站并留在生化系任教，1996～2000年为副教授，2001年为教授、博士生导师；其中，1998～2000年分别在德国慕尼黑大学生物系、日本东北大学药学部、美国哈佛大学医学院生化与分子药学系从事访问学者工作，1999年1月～2010年5月任南京大学生化系系主任，2006年任上海大学兼职教授，2008年11月～2011年10月任上海大学生命科学学院院长；主要从事生物分子识别与传感及定量分析方法的研究；已发表SCI论文230余篇，他引6500余次，参编Encyclopedia of Sensors 等丛书，并编写了Electrochemical Analysis of Proteins and Cells 等专著；先后担任中国生物化学与分子生物学会理事会理事、蛋白质专业委员会副秘书长、副主任兼秘书长、中国生物物理学会理事会理事、中国仪器仪表学会化学传感器专业委员会委员。

http://www.x-mol.com/university/faculty/48460