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朋友的敌人的朋友?Nature报道“曲线抗癌”的USP7小分子抑制剂

标题有点绕,暂时先放在一边,向下看。


转录因子p53蛋白是一种重要的抑癌蛋白,作为“基因组守护者”,它维护细胞的基因组稳定、抑制或阻止基因突变,从而抑制肿瘤的发生。但在近50%的人类肿瘤中,p53蛋白会因基因突变、异常降解等各种原因无法履行职责。比如,在一些肿瘤细胞中泛素E3连接酶MDM2会过度表达,与p53蛋白结合之后促进其泛素化并降解,直接降低p53蛋白的稳定性和活性,帮助肿瘤逃避打击。MDM2不但自己“作恶”,头上还有一把“保护伞”——泛素特异性蛋白酶USP7,研究发现USP7能保护MDM2免于泛素化,从而逃避被降解的命运。对于人类来说,USP7就是朋友(p53)的敌人(MDM2)的朋友,这一番多角关系可以用下面这张示意图来大致说明。

图1. MDM2江湖恩仇录2。注:原图来自“王少萌:从化学走向四亿美元新药”/ 黑衣人,本文稍有改动


如果能稳定或重新激活p53蛋白,就可以成功打击肿瘤,这一策略理论上通过抑制MDM2或者抑制USP7都能实现。近日,一个国际科学家团队发现了两个小分子化合物FT671和FT827,能够高亲和性、高特异性地抑制USP7,提高p53蛋白水平,并且在小鼠模型中抑制肿瘤生长。他们还阐明了这种抑制作用的分子机理。这一研究成果发表在近期的Nature 上。

图2. FT671和FT827的分子结构式,酒红色部分为PyrzPPip母核结构。图片来源:Nature


过去也曾有过小分子化合物作用在USP7上的报道,但它们的动力学窗口较窄(P22077或P5091为20-40 μM,HBX41108为25-50 μM)。尽管P22077或P5091可以达到稳定p53的目的,但副作用很明显,它们同样会抑制相关或不相关的酶。本文作者通过泛素-罗丹明实验筛选了FORMA Therapeutics的50万个化合物,从中发现了几个苗头化合物,并进一步确认了它们可以直接结合USP7。他们对这些初始苗头化合物的活性和理化性质进行优化,得到了吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮-哌啶(PyrzPPip)系列化合物,从中又确定了两个小分子化合物非共价抑制剂FT671和共价抑制剂FT827(图2)。


FT827和FT671结合在USP7的催化结构域(USP7CD,208-560残基),其中FT827含有乙烯磺酰胺结构,可以共价修饰到USP7的Cys223残基上。重要的是,在38种不同族的去泛素化酶(deubiquitinases,DUBs)中,FT671和FT827仅抑制USP7的活性,特异性极佳(图3)。

图3. 50 μM浓度下,FT671和FT827特异性性抑制USP7。图片来源:Nature


这两个化合物在细胞内测试中也表现抢眼,抑制USP7的活性是之前化合物P22077的10-100倍,并且一样不会对其他DUBs产生脱靶效应。质谱数据也支持这个结果,FT827和FT671抑制USP7的高亲和性和高特异性得到证实。


为理解FT671、FT827特异性抑制USP7的作用机制,作者得到了FT671、FT827与USP7CD的共晶结构,分辨率分别为2.35-2.33 Å。USP7的结构已经得到很好的解析,它就像一只手,具有大拇指、其他手指和手掌,化合物结合到拇指和手掌中的缝隙中,这个区域也是引导泛素的C端结合到活性位点上的关键区域。化合物的母核PyrzPPip结构和USP7骨架中的Asp295、Val296、来自手指的Gln297、手掌上的Phe409和Tyr465,共5个氨基酸残基作用。

图4. FT671、FT827和USP7的相互作用。图片来源:Nature


从共晶结构中可以看到,非共价抑制剂FT671中的对氟苯基结构指向手指子域,3-氟吡唑和哌啶结构指向催化中心,距离半胱氨酸Cys的硫醇4.7 Å。共价抑制剂FT827并不指向手指,而是延长至催化中心,乙烯基磺酰胺与Cys223形成共价键(图5)。结合共晶结构以及后续的突变实验,作者进一步阐明了FT671、FT827特异性抑制USP7的作用机制,在此就不做赘述了。

图5. USP7、USP-UbAl、USP-FT671、USP-FT827的晶体结构。图片来源:Nature


接下来是生物活性实验,作者选用非共价抑制剂FT671进行测试。在结肠癌细胞系HCT116或骨肉瘤细胞系U2OS中,敲低USP7的表达,可以增加p53蛋白水平并诱导下游的p21蛋白表达,导致肿瘤细胞生长停止和凋亡。加入FT671,也可达到相似的效果,这些细胞中的p53蛋白水平增加,并且启动了p53相关基因的表达,如BBC3、CDKN1A、RPS27L 等。USP7还有其他底物,因此USP7抑制剂也会影响到这些底物。例如在成神经细胞瘤细胞系IMR-32中,FT671导致N-Myc的降解和p53蛋白水平的增加。这些结果表明USP7抑制剂也适合于其他生物活性的研究。


在多发性骨髓瘤细胞系MM.1S中,FT671提高了p53蛋白的稳定性,增加MDM2泛素化,引起p53靶基因的表达,并且抑制肿瘤细胞的增殖,IC50值为33 nM。在移植MM.1S肿瘤的小鼠模型中,服用单剂量的FT671后(200 mg Kg-1),即可观测到p53蛋白水平的增加,24 h后又恢复至空白对照组的水平。在FT671每天100 mg Kg-1和200 mg Kg-1剂量下,作者观察到了对肿瘤生长显著的剂量依赖性抑制。FT671的大剂量耐受性也很好,研究期间,并未发生老鼠体重减轻或消瘦萎靡等现象(图6)。

图6. FT671的生物活性实验结果。图片来源:Nature


抑癌蛋白p53的作用非常重要,能够稳定或重新激活它的生物学功能的药物自然倍受瞩目。所谓朋友的敌人的朋友就是敌人,本文作者发现的两个小分子,可以高特异性、高亲和性地抑制敌人(MDM2)的朋友(USP7),从而稳定p53蛋白并抑制肿瘤。这种策略还有希望用于指导开发针对其他无成药性(undruggable)的难缠药物靶点的药物。


原文(扫描或长按二维码,识别后直达原文页面,或点此查看原文):

Molecular basis of USP7 inhibition by selective small-molecule inhibitors

Nature, 2017, 550, 481-486, DOI: 10.1038/nature24451


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